Formado en el taller paterno, en 1534 se encargó ya en solitario del retablo de San Eloy en la iglesia de Santa Catalina, dañado en un incendio en 1584 y copiado por Francisco Ribalta. De él subsiste únicamente la tabla de la Consagración de san Eloy como obispo de Noyon, conservada en el Museo de la Universidad de Tucson, la primera obra plenamente autógrafa que se le puede asignar. Se conjetura si Juanes estudió en Italia, pues recibió la influencia de la pintura de dicho país, especialmente de Sebastiano del Piombo. Los historiadores tienden a pensar que nunca salió de España y que, como su padre, absorbió esas influencias observando las pinturas extranjeras que llegaban al Reino de Valencia. Concretamente, de Sebastiano del Piombo, existían varias obras importantes, que fueron copiadas e imitadas por múltiples artistas.
En la Valencia de su época Juan de Juanes fue el pintor de mayor relevancia. Dedicado fundamentalmente a la iconografía religiosa, entre sus obras destacan La Santa Cena, San Sebastián en la sinagoga, La Sagrada Familia, el retablo de la Iglesia de Fuente la Higuera, Asunción de Nuestra Señora, las Bodas místicas del Venerable Agnesio (buen ejemplo del Renacimiento), el retrato del Venerable donante y La Inmaculada Concepción, que es considerada como su obra maestra, como predecesora de la tipología iconográfica que Francisco Pacheco, en su Arte de la pintura, expondrá como canónica.
Representante del Renacimiento valenciano en una época ciertamente convulsa por motivos religiosos y políticos, De Juanes consiguió crear un estilo propio y unos tipos iconográficos que serían repetidos por sus seguidores. Son importantes sus Salvadores Eucarísticos, Ecce Homos y Dolorosas. Provocó un cambio en la pintura valenciana y es el mejor representante de este ambiente prerreformista de mediados de siglo XVI.
La Valencia del Pasado 